Tế bào gốc dơi đa năng như một mô hình để nghiên cứu các loại virus mới

Dơi đã phát triển với những đặc điểm độc đáo như định vị và bay bằng tiếng vang thanh quản, với một số loài có khả năng dung nạp các loại virus như coronavirus hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng (SARS-CoVs), CoVs hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS-CoVs), cũng như virus Marburg và Nipah . Việc phát triển các mô hình dơi dựa trên tế bào mạnh mẽ có thể cung cấp hiểu biết nhiều hơn về việc xử lý vi rút và sinh học của dơi.

Trong một nghiên cứu gần đây được công bố trên bioRxiv* máy chủ in sẵn, các nhà nghiên cứu đã tạo tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSCs) từ Rhinolophus ferrumequinum dơi sử dụng giao thức Yamanaka đã được sửa đổi để thiết lập loài dơi như một cuốn tiểu thuyết in vivo nghiên cứu mô hình loài.

Nghiên cứu: Tế bào gốc đa năng của dơi tiết lộ sự vướng víu độc đáo giữa vật chủ và virus. Tín dụng hình ảnh: Jezper / Shutterstock.com

Về nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu điều tra xem liệu loài dơi có thể thích hợp để sản xuất virus hay không.

Phương pháp tái lập trình Yamanaka được sử dụng dựa trên các yếu tố tái lập trình như gen Y-box 2 vùng xác định giới tính, yếu tố phiên mã liên kết octamer 4 (Oct4), cMyc và yếu tố giống Kruppel 4 (Klf4).

Tế bào nguyên bào sợi phôi dơi (BEF) được phân lập từ R. ferrumequinum, với số lượng các yếu tố lập trình lại được thay đổi để kích hoạt và chặn một số đường truyền tín hiệu. Ngoài ra, các phân tích nhuộm màu miễn dịch và giải trình tự axit ribonucleic (RNA) (RNA-seq) cũng được thực hiện.

Nguồn gốc của tế bào gốc dơi đa năng. (A) Hình minh họa về chiến lược dẫn xuất tế bào gốc đa năng của dơi. BEF, nguyên bào sợi phôi; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, môi trường nguyên bào sợi; PSC, môi trường tế bào gốc đa năng; PSC +, PSC có phụ gia. (B) Hình thái của các khuẩn lạc tế bào BiPS đã thành lập được phát triển trên nguyên bào sợi phôi của chuột. (C) Phát hiện miễn dịch huỳnh quang của Oct4 trong các tế bào BiPS. (D) Biểu đồ MA của dữ liệu RNA-seq minh họa sự khác biệt trong phiên mã giữa nguyên bào sợi phôi dơi (BEF) và tế bào gốc đa năng (BiPS). Các gen được chọn với các chức năng đã biết trong việc thiết lập hoặc duy trì tính đa năng được làm nổi bật. (E) Phân tích cụm Kmean của các tín hiệu ATAC-seq thu được từ các ô BEF hoặc BiPS. C, cụm. (F), Biểu đồ mật độ của kết quả RRBS thu được từ các ô BEF và BiPS. Hệ số tương quan PCC, Pearson. (G) Biểu đồ phân tán của trạng thái methyl hóa histone 3 tại K4 (kích hoạt biến đổi nhiễm sắc) hoặc K27 (kìm hãm biến đổi nhiễm sắc) sau khi ChIP-seq từ các tế bào BEF hoặc BiPS như được chỉ ra. (H) Biểu đồ phân tán của H3K4me3 và H3K27me3 trong các tế bào BiPS minh họa sự xuất hiện của các vị trí nhiễm sắc thể hai hóa trị trong các tế bào BiPS. (I) Các tín hiệu RNA-seq, ATAC-seq và H3K4me3 hoặc H3K27me3 ChIP-seq của các gen được chọn có vai trò đã biết trong việc tái lập trình được kích hoạt (Nanog, Kit) hoặc bị kìm hãm (Thy1) trong BiPS khi so sánh với các tế bào BEF.

Tác động của phương pháp tái lập trình đã sửa đổi lên các phân tử biểu sinh dơi và chất nhiễm sắc được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm đối với chất nhiễm sắc có thể tiếp cận được với transposase bằng giải trình tự (ATAC-seq). Phân tích ánh xạ methylome axit deoxyribonucleic (DNA) và phân tích kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể và giải trình tự (ChIP-seq) cũng được thực hiện. Các giao thức được tối ưu hóa để cho phép phân biệt SC của dơi thành ba lớp mầm, trong khi xét nghiệm phân biệt cơ thể phôi (EB) được thực hiện để đánh giá tính đa năng.

Bat iPSCs (BiPSC) sau đó đã được tiêm vào chuột bị ức chế miễn dịch và các cấu trúc giống như phôi thai được tạo ra từ BiPS. Đề cương nghiên cứu đã được xác nhận bằng cách phát triển các tế bào BiPS của các Dơi myotis myotis.

So sánh cấu hình gen phiên mã và phân tích thành phần chính (PCA) được thực hiện trên Cây đước các loài dơi và các loài động vật có vú khác nhau về mặt phát sinh loài của chuột, người, chó, lợn và marmoset.

Phân tích bản thể học gen được thực hiện để đánh giá khả năng làm giàu gen hàng đầu cho các con đường sinh học cụ thể. Các đường ống mới được phát triển dựa trên sự phân loại theo hệ mét của dữ liệu axit ribonucleic tế bào gốc (RNA) theo chuỗi (RNA-seq), de novo lắp ráp contig retrovirus giả định và lập bản đồ bộ gen để xác định các lần đọc retrovirus thực sự. Thêm vao Đoa, kháng nguyên các dấu hiệu liên quan đến virus RNA đã được khám phá.

Nghiên cứu kết quả

Một tỷ lệ yếu tố lập trình lại cụ thể, cũng như yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi được bổ sung-2 (Fgf-2), yếu tố tế bào gốc (Scf), yếu tố ức chế bệnh bạch cầu (Lif) và forskolin vào môi trường nuôi cấy cho phép tăng trưởng BiPSC không bị cấm, với đồng nhất và chặt chẽ đàn dơi xuất hiện trong vòng 14 đến 16 ngày.

BiPSCs thể hiện yếu tố đa năng Oct4, với tốc độ tăng sinh giống với tốc độ tăng sinh PSC của con người. Hầu hết các tế bào chứa 56 nhiễm sắc thể và được sao chép mà không có các yếu tố tái lập trình ngoại sinh và các thay đổi hình thái.

BiPSC được phân biệt thành ba lớp mầm, sau đó hình thành EB và các chất hữu cơ. Phân tích RNA-seq cho thấy sự biểu hiện nội sinh của các gen liên quan đến đa năng chính tắc như SRY-2, Nanog và Oct4.

Tuy nhiên, cấu hình di truyền không hoàn toàn phù hợp với một trạng thái đa năng. Thay vào đó, các yếu tố trạng thái đa năng ngây thơ như Klf4 và 17, protein beta thụ thể liên quan đến estrogen (Essrb), yếu tố phiên mã E3 (Tfe3) và Yếu tố phiên mã CP2 Like 1 (Tfcp2l1)]đã được biểu hiện. Đồng biểu hiện Tfcp2l1 / protein ngón tay kẽm (Zic2) và homeobox trực tâm 2 (Otx2) / Tfe3 và các yếu tố mồi / chưa từng được quan sát.

Các thay đổi cấu hình nhiễm sắc thể và sự thay đổi methyl hóa CpG 191 đã được quan sát thấy trên bộ gen của dơi. Các phát hiện của ChiP-seq cho thấy sự trùng lặp giữa gen lưỡng tính của người và dơi, mặc dù một số gen là đặc trưng cho loài.

BiPSC đã được lập trình lại theo kiểu phiên mã và biểu sinh. BIPSCs dương tính với các dấu hiệu protein hộp ghép đôi (Pax6), 213T và alpha-fetoprotein (AFP) đối với ngoại bì, trung bì và nội bì.

Gen ERAS được điều chỉnh giảm, trong khi gen hyaluronidases và ADP ribosylation (ARFs) không thể phân biệt được giữa các nhóm. Các Cây đước blastoid cho thấy các cấu trúc phôi được gắn với biểu mô tế bào sinh dưỡng dẹt và sự mở rộng khối lượng tế bào bên trong. Myotis Các phát hiện về dơi chỉ ra rằng quy trình nghiên cứu có thể được áp dụng cho các loài dơi khác nhau.

Phân tích PCA cho thấy một nhóm tế bào gốc dơi riêng biệt. Tuy nhiên, chỉ có tám gen hàng đầu cho thấy sự chọn lọc tích cực đáng kể trong R. ferrumequinum, với hầu hết các gen thuộc loại không mong đợi. Hơn nữa, bệnh CoV là danh mục được phong phú hóa đáng kể nhất trong bách khoa toàn thư về các con đường gen và bộ gen (KEGG) của Kyoto.

Các gen collagen type III alpha 1 (Col3a1) và mucin 1 (Muc1) được phát hiện trong BiPSCs, do đó cho thấy sự thích nghi di truyền cụ thể của loài dơi. Việc lập trình lại cho thấy các trình tự retrovirus nội sinh (ERV).

BiPSC có chứa một số trình tự nội sinh hóa liên quan đến vi rút, với các vùng tương đồng với vi rút herpes 4 ở người, vi rút hợp bào hô hấp ở người và phân lập SARS-CoV-2. R. ferrumequinum trình tự gen tương tự như của CoV 229E người và CoV OC43 của người.

Một số vị trí tích hợp retrovirus tương đồng với virus như virus khỉ Mason-Pfizer, virus Koala và virus retrovirus cừu Jaagsiekte đã được xác định. Bộ gen tương đồng với các vi rút bệnh đậu mùa, bệnh vẩy nến, bệnh đậu sóc, bệnh đậu mùa khỉ và hội chứng đốm trắng.

Kết luận

Trình tự BiPSC tương tự như trình tự bộ gen của virus. Do đó, trạng thái đa năng cho phép phiên mã của dơi có thể được khai thác để khám phá các chuỗi vi rút dơi mới liên quan đến sinh lý dơi và khả năng lưu trữ vi rút của chúng.

*Thông báo quan trọng

bioRxiv xuất bản các báo cáo khoa học sơ bộ không được đồng nghiệp đánh giá và do đó, không được coi là kết luận, hướng dẫn thực hành lâm sàng / hành vi liên quan đến sức khỏe, hoặc được coi là thông tin đã được thiết lập.