Phân tích cấu trúc của vi rút đậu mùa khỉ để hướng dẫn sự phát triển của các tác nhân kháng vi rút rộng rãi

Qua Pooja Toshniwal PahariaNgày 30 tháng 9 năm 2022Xét bởi Aimee Molineux

Trong một nghiên cứu gần đây được đăng lên bioRxiv* máy chủ in trước, các nhà nghiên cứu đã khám phá cấu trúc tinh thể của vi rút đậu mùa khỉ (MPX) (MPXV) và phức hợp của VP39, một 2′-O-RNA methyltransferase (MTase) và sinefungin, một chất ức chế pan-MTase.

Số lượng trường hợp MPX đang tăng theo giờ trên toàn cầu và có thể cho thấy một đại dịch mới. Phân tích cấu trúc của MPXV có thể hỗ trợ việc phát triển các tác nhân chống vi rút hiệu quả để chống lại MPXV. Poxvirus mã hóa các enzym loại giải mã để ngăn chặn sự tích tụ axit ribonucleic chuỗi kép (dsRNA) trong quá trình nhiễm trùng có thể tạo ra các phản ứng miễn dịch kháng vi-rút bẩm sinh. MPXV mã hóa enzym poxin ức chế con đường axit deoxyribonucleic ds (dsDNA) -triggered cGAS-STING (Cyclic GMP-AMP synthase- chất kích thích gen interferon).

Sự methyl hóa nucleotide ban đầu (nt) của nắp MPXV trưởng thành (hoặc cap-1) tại vị trí ribose 2′-O đã được ghi nhận. MTase được yêu cầu bởi họ poxviridiae của vi rút (bao gồm cả MPXV) để tổng hợp cap-0 và bằng cách thêm một nhóm metyl khác tại vị trí 2′-O của ribose gần, nắp chưa trưởng thành (cap-0) có thể được chuyển đổi thành nắp trưởng thành mũ lưỡi trai. Đây là bước cần thiết để ngăn chặn sự phát triển của các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và được xúc tác bởi VP39, MTase 2′-O của MPXV.

Về nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu đã đánh giá cấu trúc phức hợp VP39-sinefungin của MPXV để cải thiện sự hiểu biết về cơ chế ức chế phân tử VP39 bởi sinefungin. Họ cũng so sánh cấu trúc với MTase 2′-O của virus RNA sợi đơn (ssRNA) như virus Zika và coronavirus hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng 2 (SARS-CoV-2).

Gen VP39 của dòng MPXV USA-May22 được tối ưu hóa codon để biểu hiện trong E. coli cho quá trình tổng hợp và nhân bản tiếp theo. Tế bào E. coli BL21 được chuyển đổi với plasmid biểu hiện VP39 và IPTG (isopropyl-bD-thiogalac- topyranoside) được thêm vào, sau đó VP39 tái tổ hợp được tinh chế. Các tế bào được ly tâm, ly giải và dịch ly giải được phân tích sắc ký. VP39 được cô đặc và trộn với sinefungin để thử nghiệm dựa trên kết tinh.

Các tinh thể hình thành ban đầu bị nghiền nát, và các màn hình hạt giống và chất nền RNA được chuẩn bị bằng cách phiên mã trong ống nghiệm. Sau đó, xét nghiệm 2´-O-MTase và phân tích khối phổ echo được thực hiện. Tỷ lệ hoạt động của MTase, sự ức chế 2´-O-MTase bởi sinefungin, và tỷ lệ chuyển đổi cơ chất (SAM) được xác định, và nồng độ ức chế tối đa một nửa (IC₅₀) giá trị đã được xác định.

Tập dữ liệu tinh thể học của các tinh thể nhiễu xạ thu được đã được phân tích. Các đặc điểm cấu trúc phức hợp VP39 / sinefungin đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng phương pháp thay thế phân tử bằng cấu trúc phức hợp VP39 / SAH của vi rút vacxin làm mô hình tìm kiếm. Để xác minh hoạt tính enzym của VP39 tái tổ hợp, hai chất nền có các bazơ áp chót khác nhau (m7GpppA-RNA và m7GpppG-RNA) đã được thử nghiệm.

Tương tác VP39-sinefungin được phân tích bằng cách xây dựng mô hình phức hợp sinefungin: RNA: VP39 để minh họa các cơ chế phân tử cơ bản ức chế VP39 bởi sinefungin. Hơn nữa, các vị trí xúc tác VP39 được so sánh với các vị trí xúc tác 2′-O-ribose từ vi rút Zika ở xa và SARS-CoV-2.

Kết quả

Cấu trúc MPX bao gồm một nếp gấp Rossman giống như nếp gấp alpha / beta (α / β), với tấm β nằm ở trung tâm bao gồm β2-β10 trong một mẫu giống như chữ J. Đáng chú ý, mô hình này cũng được tìm thấy đối với protein không cấu trúc 2′-O MTase (nsp) 1614 của SARS-CoV-2. Tấm β trung tâm được cố định tại vị trí từ một đầu bằng các xoắn alpha-1, alpha2, alpha-6 và alpha-7 và bởi các xoắn alpha-3 và alpha-7 ở đầu kia, và các mặt được nối với nhau bằng β1, β11 và α5.

Cả hai chất nền RNAS đều được chấp nhận; tuy nhiên, loại có bazơ áp chót là guanin thích hợp hơn. Sinefungin ức chế VP39 bằng một vi mạch₅₀ giá trị 41 µM. Sinefungin được phát hiện là đã chiếm trong túi SAM với gốc gốc adenin của nó nằm trong một hẻm núi nằm sâu trong lòng đất được lót bởi các sidechains loại kỵ nước của các gốc Val116, Phe115, Leu159 và Val139 với liên kết hydro. Sinefungin đã bảo vệ hiệu quả vùng 2′-O-ribose với các nhóm amin của nó gần vùng 2 ‘ribose nơi nguyên tử lưu huỳnh của SAM sẽ nằm ở vị trí khác.

Hẻm núi SAM có hai đầu, trong đó một đầu giáp với túi RNA là rất quan trọng để định vị SAM cho các phản ứng methyltransferase, và đầu đối diện nằm bên cạnh cơ sở adenine của sinefungin là không có người. Khi quan sát kỹ hơn, vị trí cho thấy một mạng lưới phân tử nước phức tạp được kết nối bằng liên kết hydro và liên kết với các gốc Glu118, Asn156, Val116 và gốc adenin.

Các phân tử dựa trên giàn giáo Sinefungin mang các chất có thể dịch chuyển các phân tử nước và tương tác trực tiếp với các gốc Glu118, Asn156 và Val116 có thể là chất kết dính đặc biệt tốt vì việc dịch chuyển các phân tử nước có thể gây ra các hiệu ứng entropi thuận lợi. Điểm tương đồng giữa MPXV SAM với Zika và SARS-CoV-2 là rất đáng chú ý. Tương tự nhau đã được quan sát thấy giữa sinefungin và các protein NS5, nsp16 và VP39 của Zika, SARS-CoV-2 và MPXV.

Dư lượng xúc tác tetrad (Asp138, Lys41, Glu218 và Lys175) cho MPXV được bảo tồn trong số ba loại virus ở xa được thử nghiệm, bao gồm cả các quy định về dư lượng. Hơn nữa, tất cả các vi rút đều sử dụng dư lượng aspartate để tương tác với nhóm amin của sinefungin. Các chế độ liên kết được bảo tồn giữa ba loại virus chỉ ra rằng một chất ức chế MTase đơn lẻ có thể được sử dụng như một tác nhân chống virus toàn thân. Tuy nhiên, sự khác biệt đã được quan sát thấy trong các chế độ liên kết vòng nucleobase và ribose.

Nhìn chung, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chất ức chế dựa trên MTase có thể là mục tiêu kháng virus.

*Thông báo quan trọng

bioRxiv xuất bản các báo cáo khoa học sơ bộ không được đánh giá ngang hàng và do đó, không được coi là kết luận, hướng dẫn thực hành lâm sàng / hành vi liên quan đến sức khỏe hoặc được coi là thông tin đã được thiết lập.